原創 | 什么是新技術方法 (NAM)? 為什么它在動物試驗替代領域這么火? - 瑞旭觀點 - 日化品

隨著歐盟及其它很多國家在化妝品領域中施行動物實驗禁令以及3R理念的普及, 使用非動物測試手段開展化妝品及化學品的安全評估一直是個熱門研究領域。以前我們把這些非動物測試手段(比如體外試驗)叫做替代測試方法(Alternative Test Methods),然而這個名字逐漸被新技術方法(New Approach Methodologies,簡稱NAM)這個新詞匯所替代。從事NAM研究的學者也越來越多，NAM早已成為毒理及法規科學會議上的明星嘉賓。對從事毒理及安全評估的法規及技術人員而言，仿佛不知道NAM就落后了一個時代。本文將詳細介紹什么是新技術方法 (NAM)，它與替代測試方法的區別以及NAM包含了哪些安全評估技術與方法。

什么是新技術方法(NAM)?

新技術方法 (NAM)被定義為可通過避免使用完整動物進行測試而提供化學品危害和風險評估信息的任何技術、方法或其組合。它的定義很廣，包括計算機模擬評價(in silico)、體外化學分析法(in chemico)和體外試驗(in vitro)方法。它還包括各種新的測試工具，如“高通量篩選”和“高含量篩選”，如基因組學、蛋白質組學、代謝組學以及一些改進的“傳統”方法。

新技術方法 (NAM)聽上去像學者們的談資，但實際上早已被歐美管理部門比如歐盟ECHA、歐盟EFSA和美國EPA納入到化學品危害評估、風險評估和管理決策中去了。通過新技術方法 (NAM)減少或替代動物測試已是大勢所趨。在未來，新技術方法 (NAM)大概率會成為提供化學品危害及風險信息的首要手段。

新技術方法(NAM)與替代測試方法有什么區別?

傳統的動物替代測試方法實際上包括體外試驗方法和改良的體內試驗方法(比如使用動物數量更少),但它們有個共同點, 都是基于”測試“的方法。新技術方法 (NAM)顯然范圍更廣，還包括了很多非”測試”方法，比如計算機模擬、交叉參照(read-across)和毒理學閾值關注(TTC)。除此以外，新技術方法 (NAM)不僅僅是替代動物測試而已，它本身就包含了很多新的毒理研究領域，比如有害結局通路（Adverse outcome pathway, AOP）。

接下來我們就看看新技術方法 (NAM)到底包含哪些常用手段和方法。

計算機模擬實驗(in silico)

借助數學模型, 人工智能等先進的計算機輔助手段, 科學家們可以利用統計學, 生物學科, 化學, 物理等基礎學科知識, 分析相關毒理學測試實驗數據, 從而預測化學品的毒性數據以及在環境中的暴露濃度，為化學品的風險評估提供關鍵信息。

定量構效關系(QSAR)

Quantitative Structure-Activity Relationship（簡稱“QSAR”）,使用數學模型來描述分子結構和分子的某種生物活性之間的關系,基本假設為化合物的活性與其結構相關。從各種分子描述符出發，通過模型算法，即可預測相關的理化性質，生物學活性，毒理學效應，環境行為和歸趨等特性。一般而言，在使用QSAR模型時，選擇合適的、預測性能好、被驗證過的模型去預測未知化合物的某種生物活性，顯得尤為關鍵，且不同模型或方法獲得的生物活性結果之間可以相互驗證最為理想，同時必須確定該物質應屬于QSAR模型的適用范圍。

常見QSAR模型（免費）有OECD QSAR Toolbox， Toxtree，EPI Suite，這些免費模型軟件基本可以滿足日常使用需求。

物質分組（Grouping/Category）和交叉參照法（READ-ACROSS）

利用了結構相近、性質相似的原理，將某些由于結構相似而遵循某個規則的物質，歸為一組（group），或一“類”（category）。通過在組內插入其他參考物質，利用“組”內各參考物質的現有數據，通過交互參照的方式（READ-ACROSS），預測其他物質缺失的理化、毒理或生態毒理性質，從而避免每種物質的每個性質進行測試的需求，節約數據成本。

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毒理學閾值關注(TTC)

毒理學關注閾值（TTC）的原理是可以對一般化學物質建立一個通用的暴露閾值(這個閾值與化學物質結構有關), 當化學物質的人體暴露劑量低于這個閾值水平時，該化學物質對人體健康造成負面影響的可能性很小(即使沒有這個化學物質的毒性數據)。

TTC方法主要用于評估化學結構明確、缺乏詳盡毒理學數據且對人體暴露量低的化學物質的風險，常用于香精香料、食品、化學原料及產品中雜質或微量添加物的風險評估。

在使用TTC方法前首先要確定該方法是否適用于目標物質的評估(TTC方法不適用于無機物，有生物蓄積性的物質和納米材料等)。然后根據Cramer決策樹確定Cramer結構分類并選取如下暴露閾值用于風險評估(假設人均體重60kg)。

Cramer I類：30 µg/kg bw/d
Cramer II類：9 µg/kg bw/d
Cramer III類：1.5 µg/kg bw/d
有機磷酸酯類：0.3 µg/kg bw/d
對于有遺傳毒性預警的物質：0.15 µg/kg bw/d

可以協助判斷Cramer結構類別的軟件有ToxTree和OECD QSAR Toolbox等。TTC完整流程評估方法如下所示：

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有害結局通路(Adverse outcome pathway, AOP)

在傳統動物毒性試驗中我們通常觀察記錄動物的死亡、突變、器官損傷、腫瘤等終點，然而這些有害結局（Adverse outcome）實際上都是起始于細胞/分子層面對暴露化合物的反應。毒性通路就是對從細胞層面分子起始事件(Molecular Initiating Event, MIE)到有害結局這一連續細胞反應和關鍵事件(Key Event, KE)的描述說明。比如化合物暴露引起的分子起始事件首先造成一系列的蛋白水平的級聯反應如受體蛋白的激活，隨后引發一系列關鍵事件比如促進某些酶的合成、細胞的增殖或死亡等，最終導致組織或器官的損傷或個體死亡甚至種群的改變。

驗證過的毒性通路中各個事件一般是可以驗證識別或可檢測的，同時它們之間的發生應具有可靠的因果關系。對于已建立且被驗證過的毒性通路，我們只需要對通路中的分子起始事件和關鍵毒性事件展開試驗即可推斷出最終的毒性損傷效應，從而避免高級別的耗時費力的動物實驗。檢測低層次（分子或細胞水平）的毒性事件通常可以使用體外或離體試驗技術開展，費用低、周期短、通量高，與傳統的動物毒性試驗相比有明顯優勢。

不過目前已經驗證過的毒性通路比較有限, 且建立新的毒性通路技術難度大，目前基于毒性通路的測試策略尚不能替代傳統動物試驗。

小結

新技術方法 (NAM) 的定義很廣泛，同時包括了測試手段和非測試方法，可以通過避免使用完整動物進行測試而提供化學品危害和風險評估信息。本文所提到常用技術有些并不能稱為真正的“新”, 但這個領域的發展是日新月異的，很多新技術比如高通量篩選、基因組學、蛋白組學和有害結局通路說不定有天會徹底改掉我們對動物試驗的依賴。

來源：瑞旭集團

作者：張霄鵬、石云波

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